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RET基因變異

發布時間:2021-07-31 17:47:59 | 來源:【藥物研發團隊 2021年7月31日】
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RET是一種原癌基因,負責編碼一種稱為RET的跨膜蛋白,該蛋白屬于一種受體酪氨酸激酶??缒さ鞍追譃槿齻€部分:蛋白的一端位于細胞外,一部分位于細胞膜中,另一端則位于細胞內。當RET蛋白與其配體——細胞外信號分子家族的膠質細胞源神經營養因子(GDNF)結合時,其將引起RET蛋白受體的磷酸化并使RET進入激活狀態。被激活的RET將磷酸化其底物,造成下游信號通路的激活。

RET蛋白參與的信號通路包括PI3K-AKT-mTOR途徑以及RAS-RAF-MEK-ERK途徑。PI3K-AKT-mTOR途徑參與細胞存活,而RAS-RAF-MEK-ERK通路參與細胞增殖。因此RET蛋白在細胞存活、遷移、增殖上有著一定的作用。

RET基因發生致病性突變——突變或重排,進而激活RET基因,并可能編碼出具有異?;钚缘腞ET蛋白,其將傳遞異常信號并造成多方面的影響:包括細胞生長、生存、侵襲、轉移等。持續的信號傳遞會造成細胞的過度增殖,因此導致腫瘤的發生與進展。

RET的異常激活是多種實體瘤生長和增殖的重要驅動因素。常見的RET基因變異主要有RET融合、RET突變2種形式,RET融合常見于乳頭狀甲狀腺癌(PTC)和非小細胞肺癌(NSCLC),而RET突變在甲狀腺髓樣癌(MTC)和多發性內分泌腫瘤2(MEN2)中更為常見。

由南昌弘益藥業有限公司自主研發、具有自主知識產權的LMV-12(HE003)主要作用于c-Met、VEGFR、RET、PDGFR等多個腫瘤發生、發展的關鍵靶點,目前正在進行I期臨床試驗。

一、RET基因的發現

RET基因的發現,是在1985年由哈佛大學醫學院的三位科學家完成的,他們使用DNA轉染法,以人T細胞淋巴瘤DNA轉染小鼠的NIH-3T3細胞。如果轉染后有此前尚未發現的新“集落”形成,就提示可能激活了新的癌基因。

Ras家族的多個基因,就是這樣被發現的。哈佛團隊在研究中發現,被轉染誘導形成的新基因,包含兩個在正常人體細胞或淋巴瘤細胞內,原本不連接在一起的DNA片段。

經轉染發現的RET重排基因,與正常人腎臟細胞DNA或淋巴瘤細胞DNA相比,缺少長度>16kb的DNA片段,提示可能發生了內部缺失,或不相連DNA片段的重組,這與腎臟細胞或淋巴瘤細胞DNA存在明顯區別,如不存在6.3Kb/2.3 Kb處的Eco RI片段,卻與轉染后的NIH3T3細胞DNA更接近

此后研究證實,RET基因是一種能促進癌細胞增殖和存活的原癌基因,但它真正被重視是在2011年底,韓國研究團隊最早報告了一例檢出KIF5B-RET融合的NSCLC患者。

肺癌患者的群體之龐大,遠遠不是之前RET基因變異比較多見的甲狀腺癌、多發性內分泌腺瘤病2型(MEN2)等癌癥能比的,這使得相關的科研探索和藥物研發瞬間加速,也讓科學界對RET基因有了更多的了解。

二、RET基因

RET基因是個原癌基因,位于10號染色體長臂(10q11.21),

負責編碼的是一種受體酪氨酸激酶,它是一種跨膜蛋白,由胞外區、跨膜區和胞內酪氨酸激酶活性區三部分組成。受體酪氨酸激酶在正常器官和成年組織類型中起到維護的作用,當RET基因出現點突變或基因重排時,便會驅動腫瘤的發生。

人類RET基因圖譜在10q11.2上,由21個外顯子組成,估計大小約為55 kb。RET的生理配體屬于神經膠質細胞源性神經營養因子(GDNFs)家族,該家族共包括neurturin、persephin、artemin及 GDNF 四個成員。RET的激活是由 GFRα 1/2/3/4四個受體和GDNFs四個配體之間的相互作用來完成,GFRα能特異性地結合GDNFs家族成員,促使RET蛋白受體的磷酸化并使RET進入激活狀態,激活與細胞增殖,遷移和分化有關的下游信號通路:一條是Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK通路,另一條是PI3K/Akt/mTOR通路。其他通路還有:PLC-γ通路,JAK-STAT通路等。RET在正常的神經元、交感神經和副交感神經節、甲狀腺C細胞、腎上腺髓細胞、泌尿生殖道細胞、睪丸生殖細胞等都有表達。

三、正常RET基因的功能

無配體刺激的野生型RET,是正常的RET結構。在胚胎發育期,RET基因對器官生成、神經發育等過程均有重要的作用,有研究顯示敲除RET基因的小鼠出生1天后,就會因為腎臟不發育和先天性巨結腸死亡。而在成年人體組織內,RET基因主要在腎上腺髓質、甲狀旁腺、小腦、外周血單核細胞等表達,但對機體功能影響相對胚胎發育期較小,如特異性敲除中腦多巴胺神經元的RET基因,可能會對其長期生存有一定影響。

總而言之,正常的RET基因在胚胎發育期的生理意義相對較大,在成年人體內影響有限。一般情況下RET蛋白的活化需要依賴其配體——神經膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)家族受體(GFLs),但GFLs并不直接結合到RET蛋白上,而是先結合GDNF家族受體α-共受體(GFRα1-4),形成配體-共受體復合物。

配體-共受體復合物再結合到RET蛋白上,介導RET同源二聚體形成,然后經胞內結構域磷酸化完成活化,活化的RET蛋白能夠激活Ras/ERK、PI3K/AKT等信號通路促進細胞增殖,從而在器官發育和組織穩態中發揮作用。

四、RET基因變異

RET基因的異常激活是多種實體腫瘤生長和增殖的關鍵驅動因素。

RET基因的位置、結構和常見改變

RET基因位于10號染色體上,由20個外顯子組成。RET受體由一個包含鈣粘蛋白樣結構域和富含半胱氨酸結構域的胞外結構域、一個跨膜結構域和一個胞內酪氨酸激酶結構域組成。最常見的RET突變和相關的遺傳綜合征發生在富含半胱氨酸的結構域和酪氨酸激酶結構域。通常根據癌癥部位確定RET融合。

(二)RET基因變異的發現

1990年,Grieco報告一個涉及到RET基因的染色體重排與乳頭狀甲狀腺癌的發生有關,染色體的重排可能導致RET基因中間發生斷裂,RET基因的3’端激酶結構域與不同的基因發生融合,形成驅動腫瘤增殖的融合基因。這些基因包括:CCDC6、NCOA4、PRKAR1A、TRIM24、GOLGA5、TRIM33、KTN1、ERC1、MBD1、和TRIM27等等。5%~40%的乳頭狀甲狀腺癌(PTCs)發現有RET基因融合,需要注意的是乳頭狀甲狀腺癌中的RET基因重排與電離輻射有關,即環境有核輻射等發生的該種癌癥,可能更多的涉及到RET基因的重排。

甲狀腺髓樣癌(MTC)中也可觀察到RET基因的突變,不過這種突變形式是點突變導致的RET基因激活突變。需要注意的是生殖細胞的RET基因突變,幾乎出現在所有的遺傳性甲狀腺髓樣癌中,包含多發性內分泌腺瘤病2型。后天的甲狀腺腺髓樣癌中,RET突變也出現在50%的患者中。這一點尤其要注意,不像是ROS1,RET基因是有點突變的,而且這種突變與甲狀腺髓樣癌有很強的相關性。染色體發生重排導致的RET基因融合也發生在非小細胞肺癌(NSCLC),RET基因融合在NSCLC的頻率約為1%~2%,目前四個RET基因的融合伴侶基因被鑒定出來,分別是KIF5B、CCDC6、TRIM33和NCOA4。其中KIF5B是最主要的融合基因,有7種突變形式。RET基因在其他腫瘤也有發現,相應的基因突變頻率大小不一,其中甲狀腺腫瘤比較高,尤其是遺傳性甲狀腺髓樣癌。

(三)常見的RET基因變異類型

常見的RET基因變異類型主要有突變、融合、擴增、重排、基因拷貝數變異增加(RET CNV Gain)、基因拷貝數變異減少(RET CNV Loss)6種。

1、RET基因突變

基因組DNA分子發生的突然的、可遺傳的變異現象稱為基因突變。從分子水平上看,基因突變是指基因在結構上發生堿基對組成或排列順序的改變?;螂m然十分穩定,能在細胞分裂時精確地復制自己,但這種穩定性是相對的。在一定的條件下基因也可以從原來的存在形式突然改變成另一種新的存在形式,就是在一個位點上,突然出現了一個新基因,代替了原有基因,這個基因叫做突變基因。于是后代的表現中也就突然地出現祖先從未有的新性狀。

1個基因內部可以遺傳的結構的改變稱為點突變,通??梢鹨欢ǖ谋硇妥兓?。廣義的突變包括染色體畸變。狹義的突變專指點突變。實際上畸變和點突變的界限并不明確,特別是微細的畸變更是如此。野生型基因通過突變成為突變型基因。突變型一詞既指突變基因,也指具有這一突變基因的個體。

基因突變可以發生在發育的任何時期,通常發生在DNA復制時期,即細胞分裂間期,包括有絲分裂間期和減數分裂間期;同時基因突變和脫氧核糖核酸的復制、DNA損傷修復、癌變和衰老都有關系,基因突變也是生物進化的重要因素之一。

RET基因突變包括EC區域(胞外結構域)RET基因突變、IC區域(胞內結構域)RET基因突變和TK區域(激酶結構域)RET基因突變。

胚系RET突變是MN2的病理特征之一,MEN2是一種常染色體顯性多腫瘤緣合征,其中大于90%為MEN2A,以及MEN2B和家族性甲狀腺髓樣癌(FMC)。98%~100%的RET突變可通過分子檢測識別,最常定位于細胞外和激酶域。

細胞外結構域突變在MEN2A和FMTC中更常見,涉及富含半胱氨酸的結構域,可導致RET配體非依賴性二聚化和結構性活化。第11外顯子的634位密碼子突變(p. C634R)MEN2A患者中最常見的突變(85%)。而FMTC的突變均勻分布在各種半胱氨酸殘基中。激酶結構域突變是MEN2B綜合征的病理特征,其中最常見的是第16外顯子p.M918T突變(95%),其次是p. A883突變(2%~3%)。其他還有錯義突變,如MEN2A綜合征的第13外顯子p. E768D和p. L790F,第14外顯子p. V8041和p. V804M,第15外顯子p. S891A,以及FMTC的第13外顯子p. E768D和p. L790F,第14外顯子p.V804.和p. V804M,多與無痛性疾病或更晚的疾病發病相關。

大于65%的散發性MTCs患者中具有體細胞RET突變,并與侵裝性表型相關。晚期MTCs患者中,RET突變的發生率高達90%,其中第16外顯子p. M918T突變最常見。體細胞RET突變也可見于間變性甲狀腺癌(4.3%)、黑色素瘤(6.6%)等惡性腫瘤但多為“過客”突變。

2、RET基因融合

融合基因是指將兩個或多個基因的編碼區首尾相連,置于同一套調控序列(包括啟動子、增強子、核糖體結合序列、終止子等)控制之下,構成的嵌合基因。融合基因的表達產物為融合蛋白。

RET基因斷裂位點常發生在第11號內含子,可導致由12~18外顯子編碼的RET的3’激酶結構域與不同上游伴侶基因編碼的5'端殘基融合。根據斷點位置的不同,嵌合的RET蛋白可能包含RET胞質結構域,同時也保留跨膜結構域。RET融合蛋白主要通過兩種機制發揮致癌作用。首先,上游伴侶基因通常普遍表達,致使在正常情況下RET轉錄沉默的細胞中出現RET激活和異常表達。第二,上游伴侶基因編碼的二聚體結構域與RET激酶結構域融合時,可導致不依賴配體的二聚化并激活RET。

研究報道顯示,散發的PTC中,RET融合發生率為5%~10%。大于90%的RET融臺PTCs患者具有CCDCG-RET或NCOA4-RET融合基因。1%~-2%的NSCLC患者中存在RET融合,最常見的融合伴侶基因是KIFSB,其可導致RET表達增加2~30倍。通常認為RET融合與常見的KRAS或EGFR突變、ALK或ROS1重排互斥,與低腫瘤突變負荷和PD-L1低表達相關。RET融合也見于結直腸癌、乳腺癌、Spitz腫瘤、卵巢癌和唾液腺癌等,占比小于1%。

3、RET基因擴增

RET基因擴增是指RET基因的拷貝數選擇性地增加而其它基因的拷貝數并未按比例增加的過程。

RET基因擴增產生的可能原因主要有由錯誤的DNA復制和修復導致的基因復制;自私遺傳元件偶然捕獲而導致的DNA重復;人工聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。

4、RET基因重排

RET基因重排是指一個RET基因從遠離啟動子的地方移到距啟動子很近的地方從而啟動轉錄的方式。

RET基因結構重排的機制是一種DNA雙鏈斷裂的修復過程,在等位基因內或等位基因之間,出現了重復單位復雜的轉換式移動。DNA雙鏈斷裂常發生在靠近串聯重復序列的5’端的重復單位內,形成DNA分子的兩個游離的、突出的單鏈末端。但是在修復的過程中,兩末端因擺動或錯位,沒有按照原配對堿基的位置復性,出現了基因內重排和基因間重排兩種后果:

(1)基因內重排

基因內重排的一個結果是錯位鏈最末端的堿基率先復性,然后局部合成空缺的堿基,經過修復形成一個或幾個插入重復單位。因為是發生在同一DNA分子內的單鏈插入,故這種基因的轉移是一種基因內轉換形式?;騼绒D換重排可以反復出現,每出現一次就增加一段插入序列,所以這種錯位復性及修復方式在小衛星座位一般都是增加了重復單位數。

(2)基因間重排

另一種修復的結果更多見,DNA斷端的游離單鏈末端侵入到對應的染色單體上的等位基因,與另一條染色單體的DNA發生復性,結果形成了兩同源染色單體的基因之間轉換式移動。這類單鏈侵入形式導致異源鏈合成、延伸,會出現三種不同的后果:

①從重復序列開始的錯配新合成鏈,多數在達到重復序列的側翼序列之前就被DNA錯配修復系統終止,只能形成基因插入轉換。

這種修復后的重排方式最多見。

基因間重排

②第二種是以對應同源染色單體的等位基因為模板合成的錯配鏈一直延伸到小衛星重復序列的側翼區,并連同側翼序列中可能存在的SNP基因座的堿基變異一起發生了基因間轉換,這種重排同時涉及小衛星重復單位和側翼序列SNP基因座,因此稱為基因共轉換。共轉換的方式相對較少。

③第三種結果更少見,即延伸的雜合雙鏈沒有終止,越過串聯重復區段,最后形成典型的Holliday連接結構,然后出現基因間重組交換的過程,經過不同的拆分方式形成同源染色單體之間的互換產物。對小衛星和側翼SNP標記的基因共轉換觀察,也發現轉換事件與側翼SNP的某種單倍型有明顯的關聯,推測小衛星序列的基因轉換重排可能受到側翼DNA序列的調節。

五、RET基因變異發生率

2017年《Clin Cancer Res》發表的在4871例已測序的癌癥中,發現 RET變異總體頻率為1.8%。

RET基因改變最常見的是突變(38.6%)> RET融合(30.7%)> RET擴增(25%)> RET重排(3.4%)> RET CNV Gain(1.1%)= RET CNV Loss(1.1%)。

六、存在RET基因變異的主要腫瘤類型

存在RET變異的腫瘤主要有:乳頭狀甲狀腺癌(PTC:7%~27%)、甲狀腺髓樣癌(MTC:40%~80%)、未分化甲狀腺癌(ATC:4%~16.7%)、多發性內分泌瘤IIA/IIB型(MEN2A/B:>98%)、非小細胞肺癌(NSCLC:0.7%~2%)、嗜鉻細胞瘤/副神經節瘤(3%~6%)。除上述腫瘤外,RET變異很少發生在其他實體腫瘤中。

七、檢測RET基因變異的臨床意義

1、預測RET抑制劑的臨床療效;

2、RET基因突變與甲狀腺髓樣癌(MTC)預后負相關。

3、遺傳性RET基因突變與多發性內分泌瘤IIA/IIB型(MEN2A/B)及家族性甲狀腺髓樣癌(FMTC)相關;

4、如果在其他腫瘤中出現RET基因突變,不要緊張,因為只有一小部分是RET基因激活突變,大部分都不是激活突變。

八、RET基因變異的促癌機制

如果出現RET基因融合、點突變等促癌變異時,RET蛋白會發生不依賴配體的異常過度激活。例如MEN2A中常見的RET錯義突變,往往發生在細胞外富含半胱氨酸的結構域,使RET蛋白不結合配體就形成同源二聚體并活化。RET基因點突變還可能發生在細胞內的激酶結構域,例如MEN2B型中最常見的M918T突變,活化RET蛋白就不需要形成同源二聚體,而是通過增強RET蛋白與ATP的親和力,并使RET的活化單體更加穩定,激活下游信號通路促癌。

而在發生RET基因融合時,雖然RET基因細胞外的結構域會丟失,但KIF5B、CCDC6等伴侶基因往往帶有卷曲螺旋結構域,其會在新蛋白中誘導同源二聚化過程,從而使RET激酶結構域不依賴配體就持續激活促癌。

NSCLC、甲狀腺乳頭狀癌(PTC)中,最常見的RET基因促癌性變異是RET融合,而甲狀腺髓樣癌(MTC)、MEN2中較常見的則是體細胞/生殖細胞點突變。其中RET基因融合的發生相對復雜,也是近年來科研探索的重點。

RET融合的發生機制

機體受到各種內源性/外源性因素的刺激,細胞內的DNA每時每刻都可能出現損傷,其中DNA雙鏈斷裂是最嚴重的損傷之一,會直接威脅細胞的生存,細胞內有兩條修復通路用來減少DNA復制錯誤和損傷,分別是同源重組修復(HR)和非同源末端連接(NHEJ)。

HR通路屬于“慢工出細活”式的精準修復,而NHEJ就有點不管三七二十一,先把DNA雙鏈連上再說,這樣修復就可能導致染色體的基因重排,使融合基因出現。

2014年日本學者對14例檢出RET融合的肺腺癌患者進行分析,發現這些患者RET基因斷裂的位點,基本都位于11號內含子上,而且一大半都是NHEJ機制修復的結果,最終表現為RET基因的3’端激酶結構域,與KIF5B等基因發生了融合。NHEJ對KIF5B、RET基因斷裂的異常修復,導致KIF5B-RET融合發生。

NHEJ修復外,RET基因或伴侶基因出現DNA單鏈斷裂,引發的斷裂誘導復制(BIR)也可能參與了RET融合的發生。在結直腸癌等癌癥中,還有研究報告了位于7號、10號內含子等較罕見的RET融合斷裂位點。

而輻射則是RET基因融合發生的已知危險因素,有學者分析了曾在切爾諾貝利核事故區居住的26例PTC患者,其中15例就檢出了RET融合,遠高于正常環境下PTC患者中RET融合7%~20%的發生率。

不同種類的癌癥中,與RET基因融合的“伴侶基因”也不同,NSCLC中大多數都是KIF5B,而PTC中以CCDC6、NCOA4為主,此外還有幾十個基因可能與RET融合,這些伴侶基因對RET融合腫瘤生物學行為的影響,還有待進一步研究。

RET基因點突變/融合的具體促癌機制

RET基因點突變/融合的具體促癌相關機制都還沒有被徹底闡明,但目前認為這兩種變異都會強力激活下游的PI3K/AKT、RAF/MEK/ERK等信號通路,延長細胞生存、促進細胞增殖,還會增強侵襲性并促進新生血管生成。

RET基因變異或能調節免疫微環境

被促癌性基因變異或GFLs激活后,RET基因還會誘導促炎性蛋白,如細胞因子、趨化因子及相應受體的表達,這些促炎性蛋白可能直接作用于腫瘤細胞或腫瘤微環境,促使腫瘤相關炎癥發生。

RET活化誘導的促炎性蛋白表達,還可能招募更多淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等免疫細胞向腫瘤浸潤,這些免疫細胞也有一定水平的RET表達,從而可能在GFLs的激活下,參與促癌增殖和侵襲性轉移的過程。已有研究提示在MEN2中,對應類型的RET突變會導致抑制性腫瘤微環境,從而不利于免疫治療。

2021年美國NCCN非小細胞肺癌臨床實踐指南中,也將RET基因融合列為可能導致免疫檢查點抑制劑治療缺乏獲益的原癌基因之一,與EGFR、ALK等驅動基因并列,不過這是否與免疫微環境的改變相關,還需要更多研究探索。

九、如何發現RET基因變異的患者

從發生頻率來說,RET基因變異是不折不扣的罕見突變:2017年美國學者分析了39種組織學類型不同癌癥,共4871例腫瘤組織樣本的測序結果,其中只有88例檢出了RET基因變異,包括34例點突變、27例融合和22例擴增,整體的檢出頻率為1.8%。而如果具體到癌癥類型的話,RET融合在PTC和NSCLC中的檢出頻率,分別約為5%~10%和1%~2%,在其它癌癥中都極其罕見,而在較多見RET點突變的MTC患者中,報告的檢出率在43%~90%不等。

一些真實世界大樣本分析則顯示,RET基因融合NSCLC患者一般有著年輕、不吸煙、組織學類型非鱗癌等特點,與ALK融合等罕見突變的患者相似,可以對這類患者重點開展二代測序(NGS),爭取找到RET基因融合等有藥可用的突變。

NSCLC治療已經全面進入精準化、個體化時代的今天,以基因檢測結果指導用藥已經不是稀罕事。哪怕是RET基因變異這樣相對罕見的位點,也應該納入到必須檢測的基因范圍,從而為患者找到改善治療結果的機會。

我國2021年版《非小細胞肺癌分子病理檢測臨床實踐指南》,就將RET基因的檢測內容納入其中,而6月份最新的《中國非小細胞肺癌RET基因融合臨床檢測專家共識》發布,能夠進一步指導臨床將RET檢測實踐規范化。

從發現RET基因融合肺癌患者,到有特異性的抑制劑可用,十年也不過是彈指一揮間。而在有藥可用的同時,也需要遵循指南和共識,樹立對RET基因的檢測意識。醫生積極檢測,患者主動配合,才能真正讓RET基因變異的靶向治療走上快車道。

十、RET基因檢測

目前已有多種方法用于檢測RET基因變異,臨床實踐中應根據RET變異類型(融合或突變)、患者背景、可使用的組織數量和質量、腫瘤類型以及成本效益等綜合分析后選擇適宜的檢測方法。

對于甲狀腺癌患者,細針穿刺(FNA)細胞學檢測結果不確定的可以受益于特異的分子檢測(RET/PTC),有助于治療方案的決策選擇;臨床表現與MTC一致的患者應篩選生殖系統RET突變;復發時,分化型甲狀腺癌(PTC)患者應考慮進行RET融合檢測;對于肺癌患者,不建議在臨床試驗之外進行常規的RET基因獨立檢測;應制定包括更大NGS Panel方法在內的RET基因檢測方案,并且應當在EGFR、ALK和ROS1常規檢測為陰性的情況下,嘗試進行RET基因檢測。同時,回顧性NGS檢測研究發現,RET基因融合和其他的基因改變并非相互排斥,是可以共存的。

RET基因融合檢測

RET基因的變異類型有多種,其中基因融合變異具有重要的意義,其檢測方法也有多種。RET基因融合的檢測方法主要有IHC、FISH、RT-PCR 、表達不平衡、DNA-NGS和RNA-NGS六種。

1、IHC法

(1)優勢:可以本地進行檢測;

(2)缺點:使用組織進行檢測,將有顯著的假陽性(FP)或假陰性(FN)。

不推薦采用IHC法檢測RET基因融合。

2、FISH法

(1)優勢:可以本地進行檢測;

(2)缺點:對于檢測結果的解釋具有挑戰性,較難確定RET陽性的標準cutoff值(比如 ALK FISH);使用組織進行檢測,將有顯著的假陽性(FP)或假陰性(FN)。

極少數情況下推薦使用FISH檢測RET基因融合。

3、RT-PCR法

(1)優勢:快速、相對便宜;

(2)缺點:不能檢測未知的融合partners。

推薦使用RT-PCR法檢測RET基因融合。

4、表達不平衡法

(1)優勢:快速、相對便宜;

(2)缺點:要高度專業化的儀器和解釋。

推薦使用表達不平衡法檢測RET基因融合,尤其是評估多激酶融合的情況。

5、DNA-NGS法

(1)優勢:檢測各種融合的同時,可以獲取基因突變的信息;

(2)缺點:一些內含子區域覆蓋很低。

推薦使用DNA-NGS法檢測RET基因融合。

6、RNA-NGS法

(1)優勢:不存在內含子覆蓋不到的問題;

(2)缺點:高度依賴RNA的質量。

推薦使用RNA-NGS法檢測RET基因融合。

(二)RET基因重排檢測

常見RET重排的檢測取決于標本的類型,新鮮或快速冷凍組織或FNA標本首選RT-PCR技術,FFPE組織首選FISH技術。FNA樣品也可以使用多種多樣的多重檢測檢測方法進行分析,包括NGS技術。

(三)胚系突變檢測

腫瘤遺傳學方面,對于已確定RET基因突變患者的家庭成員,或已知RET基因變異、遺傳性MTC患者的家庭成員均應考慮進行胚系RET基因檢測。大約10%的MENI、2%的MEZ2A和50%的ME2BR病例是由新發胚系突變所致。對于診斷為散發性MTC或散發性MTC患者的一級親屬,以及MEN2或原發性C細胞增生的患者,可將胚系RET基因檢測取代每年的血清降鈣素生化檢測,用于C細胞增生的篩查。RET基因變異的檢測也可用于甲狀腺結節細針穿刺(FNA)活檢的鑒別診斷。

(四)原位檢測

1、免疫組織化學(IHC)

研究發現,使用IHC技術可以在甲狀腺良性病變患者中發現RET基因的表達,其在肺癌患者的RET融合檢測中亦不可靠,因靈敏度低(55%~65%)和特異性變化大(40%-85%),目前已不建議使用IHC用于RET基因變異的檢測。

2.熒光原位雜交(FISH)

FISH是目前標準的RET融合檢測方法,其具有良好的敏感性和特異性。需要強調的是,FISH檢測陽性是指>15%的細胞具有分離信號或單個3'信號,而后者還需其他檢測方法確認。判讀FISH檢測的難點包括:

(1)近中心融合;

(2)分離探針無法確認具體的融合伴侶;

(3)可能存在漏檢。

當開展廣泛、多重檢測,或是融合伴侶的識別影響患者的臨床管理時,FISH不是最佳的檢測方法。

3、核酸檢測

(1)DNA PCR檢測

DNA Sanger測序是可靠的鑒定單核苷酸變異的方法,但有可能漏檢突變率低于15%-20%的等位基因,也無法識別基因的易位,可用于已知突變類型的家族性MTC檢測。DNA定量PCR(Q-PCR)或數字化PCR適用于熱點突變的篩查,但檢測融合有局限性。

(2)RNA PCR檢測

逆轉錄—聚合酶鏈反應(RT-PCR)能夠檢測目的基因的融合轉錄本,并在特定伴侶引物下可識別融合伴侶基因,不能檢測未知的融合。未知融合伴侶時,3'/5'表達不平衡可能幫助識別融合事件,但需要進一步驗證。

(3)DNA NGS檢測

該方法在同時識別多種基因變異方面具有明顯優勢,如NSCLC的檢測,其優點主要有:①高靈敏度,可識別低突變頻率(>3%~5%)的體細胞突變或在含有較少腫瘤細胞的組織樣本中進行檢測;

②高通量,較少的組織即可檢測多個靶基因。

較小的NGS panel通常用于檢測熱點突變,更大的NGS Panel或全外顯子測序可設計檢測更多融合位點。其局限性主要在于無法獲得RET融合基因的有效轉錄信息。

(4)RNA NGS檢測

不同于DNA NGS,RNA NGS不受內含子的限制,且其能確定融合是否轉錄形成mRVA。RNA的不穩定性可能影響分析的質量。因此,RNA的質量評估是保證結果準確性的關鍵。研究顯示,RNA-seq檢測可用于DNA-seq陰性病例的檢測,從而更全面地分析基因融合的可能性,特別是在腫瘤突變負擔較低且無驅動基因突變的NSCLC中融合更為常見。

4、循環腫瘤DNA檢測RET基因融合

循環腫瘤DNA檢測RET基因融合用于ctDNA RET基因融合檢測的NGS panel主要采用雜交捕獲富集,可較好地覆蓋基因融合。近期已有高靈敏度的NGS技術用于ctDNA檢測,研究發現其與組織檢測結果具有良好的一致性。當組織學標本不足時,結合ctDNA NGS檢測結果可增加48%~65%的驅動基因突變檢測率。

未來,可應用血液ctDNA NGS分析選擇性RET抑制劑的獲得性耐藥機制,以及預測MKIs經治患者接受RET抑制劑治療的敏感性,從而推動患者治療方案的進一步優化。

十一、RET基因變異檢測注意事項

1、對于NSCLC、非MTC或其他實體瘤患者,應利用福爾馬林固定包埋(FFPE)標本檢測是否存在RET融合。若無法開展NGS,應根據可及的方法、咸本和獲取的腫瘤細胞數量選擇FISH或RT-PCR進行檢測。如果結果為陰性,建議使用NGS panel檢測。需要注意的是,應使用多基因NGS評估包括RET基因融合等NSCLC I級基因變異

對于其他實體瘤患者,除了檢測RET基因融合,還應選擇NGS檢測RET基因突變;若NGS不可及,可使用Q-PCR技術。均不建議RIET IHC檢測。

2、對于沒有可用的FFPE標本的NSCLC、非MTC或其他實體瘤患者,建議行液體活檢檢測RET基因變異。值得注意的是,如果液體活檢未能檢測到RET基因變異,仍然需要腫瘤組織檢測以明確排除RET基因融合的可能。

3、MTC患者需檢測RET基因突變,并接受遺傳咨詢以明確是否存在MEN綜合征或FMTC。RET基因突變最常見于遺傳性MTC,散發性MTC中亦可見??墒褂肣-PCR或NGS檢測患者的痰液或血液。在已知胚系RET基因突變的情況下,可對白細胞DNA進行簡單的Sanger檢測。對于胚系RET基因突變患者,應開展家庭咨詢。對于沒有胚系RET基因突變的轉移性MTC患者,應對轉移灶的FFPE組織樣本進行Q-PCR或NGS分析,以明確是否存在RET基因變異。在上述任何情況下,都不建議進行RET IHC檢測。

十二、RET抑制劑

RET抑制劑大致分為兩類:選擇性RET抑制劑和非選擇性RET抑制劑。

選擇性RET抑制劑

1、LOXO-292

美國FDA授予Loxo Oncology在研藥物LOXO-292(selpercatinib,塞爾帕替尼)突破性療法認定,用于治療:

(1)在接受含鉑類化療以及PD-1或PD-L1腫瘤免疫療法治療后病情進展、需要全身治療轉移性RET融合陽性非小細胞肺癌(NSCLC)患者。

(2)既往接受治療后病情進展且沒有可接受的替代治療選擇、需要系統治療的RET突變型甲狀腺髓樣癌(MTC)患者。

2、BLU-667

美國FDA授予Blueprint Medicines在研藥物BLU-667(普拉替尼)突破性療法認定,用于沒有其它可替代治療方案的RET突變甲狀腺髓樣癌(MTC)的治療。

目前,美國FDA已批準塞爾帕替尼和普拉替尼作為標準RET靶向治療藥物。

但近期已有研究發現,塞爾帕替尼獲得性耐藥的RET基因突變位于溶劑前沿的В(G8B/s/R)、鉸鏈(Y806C/N)、RET ATP結合位點的β2鏈(V738A)等。其中,G810C/S/R突變是觀察到的最常見的塞爾帕替尼耐藥突變,且其耐藥性最強。迄今發現的塞爾帕替尼耐藥RET基因突變也對普拉替尼交叉耐藥。研究發現L730V/I RET基因突變對普拉替尼耐藥,但對塞爾帕替尼治療敏

感。不同于G810突變,L730V/I RET基因突變位于溶劑前沿的頂部。蛋白質-藥物復合物的晶體結構顯示,L730V/I突變導致了與普拉替尼更強的空間沖突,同樣在模型中,研究者也發現了普拉替尼不能抑制BaF3/KIF5B-RET(L730V/I)細胞來源的移植瘤的生長,但塞爾帕替尼可有效抑制這些腫瘤的生長。

(二)非選擇性RET抑制劑(多靶點抑制劑)

非選擇性RET抑制劑主要有Cabozantinib(卡博替尼)、Vandetanib(凡德他尼)。

由南昌弘益藥業有限公司自主研發、具有自主知識產權的LMV-12(HE003)主要作用于c-Met、VEGFR、RET、PDGFR等多個腫瘤發生、發展的關鍵靶點,目前正在進行I期臨床試驗。

 

 

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